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什么是电泳法
点击次数:2211 发布时间:2009-08-26
【电泳法】是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。
 
  【分类】
 
  ● 1.纸电泳法
 
  操作法 (1) 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)。取枸橼酸 (C6H8O7·H2O)39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O4.12g,加水4000ml,使溶解。
 
  (2) 滤纸 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端5~8cm处划一起始线,每隔2.5~3cm处做一记号备点样用。 
 
  (3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每10μl,共3点,并留2个空白位置;干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处zui后喷湿,本法适用于稀的供试品溶液。
 
  (4) 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源档,调整电压梯度为18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。
 
  (5) 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。
 
  ● 2.醋酸纤维素薄膜电泳法
 
  操作法
 
  (1) 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜,裁成2cm×8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。
 
  (2) 点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2~3μl,在10~12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4~5cm为宜。
 
  (3) 染色 电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2~3分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色止止。
 
  (4) 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10~15分钟,取出平铺于洁净的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长期保存。
 
  (5) 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对含量(1%)。
 
  ● 3.琼脂糖凝胶电泳法
 
  操作法
 
  (1)制胶 取琼脂糖约0.2g,加水10ml,置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)10ml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm
 
  或4cm×9cm)的玻板上,厚度约3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。
 
  (2) 标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下规定配制。
 
  (3) 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl,立即接通电源,在电压梯度约30V/cm、电流强度1~2mA/cm的条件下,电泳约20分钟,关闭电源。
 
  (4) 染色与脱色 取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
 
  ● 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳法
 
  操作法
 
  (1)制胶 取溶液A2ml,溶液B5.4ml,加脲2.9g使溶解,再加水4ml,混匀,抽气赶去溶液中气泡,加0.56%过硫酸铵溶液2ml,混匀制成胶液,立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10cm×0.5cm)中,使
 
  胶层高度达6~7cm, 然后徐徐滴加水少量,使覆盖胶面,管底气泡必须赶走,静置约30分钟,待出现明显界面时即聚合完毕,吸去水层。
 
  (2)标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。
 
  (3)电泳 将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内,每管加供试品或标准品溶液50~100μl,为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴,玻璃管的上部用电极缓冲液充满,上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA,数分钟后,加大电流使每管为2~3mA,当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处,关闭电源。
 
  (4)染色和脱色 电泳完毕,用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入,胶条即从管内滑出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10~30分钟,以水漂洗干净,再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。
 
  (5)结果判断 将胶条置灯下观察,根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分,由各组分的峰面积计算含量(1%)。
 
  ● 5.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
 
  操作法
 
  (1)制胶 用30%丙烯酰胺溶液-分离胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分离胶液,灌入模具内至一定高度(剩余体积留作制备浓缩胶用),用水封顶,聚合完毕,倾去水层。再用30%丙烯酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成浓缩胶液,灌在分离胶上,插入样品梳(如为圆盘电泳,用水封顶),待浓缩胶液聚合后,小心除去样品梳或水。
 
  (2)对照品和供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。
 
  (3)电泳 垂直板电泳:恒压电泳,初始电压为80V,进入分离胶时调至150~200V,当溴酚蓝迁移胶底处,停止电泳。
 
  (4)用卡尺或用扫描定位法测量溴酚蓝指示剂和蛋白迁移距离(如为圆盘电泳还应测量染色前后胶条长度,垂直板电泳胶片厚度低于1mm,染色前后胶片长度基本不变)。计算相相对迁移率:分子量 以R'<[m]>为横坐标,标准蛋白的分子量对数为纵坐标,进行线性回归,由标准曲线求得供试品的分子量。;纯度 取胶片(条),置薄层扫描仪,以峰面积按归一化法计算;结果判断 供试品主成分迁移率应与对照品迁移率一致。
 
  电泳缓冲液的作用是什么
 
  缓冲液在电泳过程中的作用是维持合适的pH。电泳时的正极与负极都会发生电解反应,正极发生的是氧化反应,负极发生的是还原反应。长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力,是溶液两极的pH保持基本不变。
 
  电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性,以利于DNA分子的迁移,例如,一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子,Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢;太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。
 
  电泳缓冲液还有一个组分是EDTA(乙二胺四乙酸),加入浓度为1-2mmol/L,目的是螯合Mg2+ 等离子,防止电泳时激活 DNA酶,此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。
转载:百度百科
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